| Idioma : |
|
| Comunitat enciclopèdia |Enciclopèdia Respostes |Enviar pregunta |Coneixement de vocabulari |Pujar coneixement |
La hibridació fluorescent in situ |
 |
|
La hibridació fluorescent in situ Breu introducció La fluorescència en el mètode d'hibridació in situ és un mètode de dibuix mapa físic, utilitzant la sonda marcada amb fluoresceïna per detectar la sonda i cromosomes en metafase od'hibridació de la cromatina en interfase. La hibridació fluorescent in situ (hibridació fluorescent in situ, FISH) a finals de 1980, radioactiu en les tècniques de hibridació in situ desenvolupades sobre la base d'un no radioactius tècniques de citogenètica molecular per reemplaçar marcador fluorescent formar un marcat isotòpicament Les noves espècies en hibridació in situ, la sonda associada amb una primera molècula intervinguda (molècula informadora) amb el procés híbrid a continuació, a través de la connexió de colorant fluorescent immunocitoquímica. PEIX El principi bàsic és l'ADN (o ARN) amb sondes marcadors moleculars específics de nucleòtids, i la hibridació de la sonda directament en el cromosoma o llesques de fibra d'ADN i després amb fluoresceïna-conjugats d'anticossos monoclonals per detectar sondes de molècula específica de la seqüència de la molècula d'unió a ADN cromosòmic o fibres d'ADN qualitativa slice, el posicionament, l'anàlisi quantitativa relatiu. FISH és segur, ràpid, d'alta sensibilitat, la sonda es pot emmagatzemar durant llargs períodes de temps pot mostrar una varietat de colors, etc, no només pot mostrar metafase, sinó que també es mostra en el nucli en interfase. mentre que sobre la base de la fluorescència d'hibridació in situ i el desenvolupament d'una fluorescència multi-color de la hibridació in situ i fluorescència fibra de cromatina d'hibridació in situ.Fons de l'aplicació RRNA per a l'ús de la fluorescència d'hibridació in situ, les causes poden donar lloc a una intensitat de senyal de fluorescència inferior: Contingut ribosomes inferiors Baixa permeabilitat de les cèl · lules circumdants La seqüència diana pot ser un contacte inferior (a causa del plegat de la conformació ARNr, alguns de l'altra posició i la molècula d'ARNr o cadena de proteïna o d'un altre ARNr estret contacte, de manera que la sonda i la diana seqüència d'hibridació pot) Per provar si la seqüència de la cèl · lula diana és fàcil hibridació, i la prova de temperatura d'hibridació òptima es pot utilitzar per "clonar fluorescència d'hibridació in situ" (clon-FISH) de prova: el gen ARNr incorporat en el plasmidi es va transformar en Escherichia coli expressió que constitueix el ribosoma, i a continuació, sondes marcades amb fluorescència. FISH pot ser combinat amb la citometria de flux, marcada amb fluorescència recompte de cèl · lules específic o separació. [1] Variants Fluorescència enzimàtica d'hibridació in situ (TARGETA-FISH) Tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH) detallen 1974 serà la primera vegada que Evans bandeig cromosòmic tècniques i hibridació in situ en combinació, millorar la precisió de posicionament. A finals de 1970, la gent va començar a explorar la hibridació fluorescent in situ, és a dir, tecnologies FISH. 1981 Harper va aconseguir seqüències d'ADN d'una sola còpia dirigits a mostres G-bandes, que marca la tecnologia de localització cromosòmica ha aconseguit importants avenços. En la dècada de 1990, amb la realització del projecte del genoma humà, ja que la cartografia d'alta resolució de les necessitats del genoma humà, tecnologia pesquera ha estat el ràpid desenvolupament i l'àmplia aplicació. Principi PEIX tècnica (hibridació fluorescent in situ) és una important no radioactiu d'hibridació in situ. El seu principi bàsic és: si el cromosoma detectat rodanxes o les fibres d'ADN amb l'ús de l'ADN diana és homòloga a una sonda d'àcid nucleic complementària, els dos desnaturalitzat - Recuit - renaturalització es pot formar amb l'ADN sonda d'àcid nucleic diana un híbrid. L'informe de sonda d'àcid nucleic en un determinat molècules marcades de nucleòtids com ara biotina, digoxina, pot utilitzar l'informe marcat amb fluoresceïna amb molècules d'avidina entre la reacció immunoquímica específica, el sistema de detecció de fluorescència en el mirall ADN que es mesura en l'anàlisi de posicionament qualitativa, quantitativa o relativa. Procediment experimental Preparació de la mostra PEIX → Preparació → sondes d'hibridació sonda marcada → → (bandeig cromosòmic) → → els resultats de l'anàlisi microscopi de fluorescència. Característica A les sondes d'hibridació in situ dividit per tipus de molècules marcadores radiomarcado i l'etiquetatge no radioactius. Marcat amb un isòtop radioactiu avantatge sonda de menys exigents en la preparació de les mostres, es pot estendre el temps d'exposició per augmentar la força del senyal, que és més sensible. El desavantatge és que la sonda és inestable, autoradiografia molt de temps, la dispersió de la radiació fa que la resolució espacial no és alta, i els isòtops operació més complicada i així successivament. Sistema d'etiquetatge fluorescent es pot utilitzar per superar aquestes deficiències, aquesta és la tècnica de FISH. Tècnica de FISH com un sistema de detecció no radioactiva té les següents característiques. Avantatges: 1, reactius fluorescents i sondes econòmica, de seguretat, 2, l'estabilitat de la sonda, ús un cop marcat dins de dos anys, i 3, període curt experimental, poden obtenir ràpidament resultats, especificitat i precisió de posicionament, 4, els peixos poden ubicat a 1kb ADN longitud de la seqüència, la sensibilitat de les sondes radioactives considerables, 5, peixos multicolors al mateix nucli a través de diferents colors es poden mostrar detectar simultàniament múltiples seqüències, 6, ja sigui en la presentació de diapositives, o el nombre de cromosomes en metafase canvis en l'estructura també es poden mostrar a la interfase estructura de l'ADN cromosoma suspensió. Desavantatges: no arribar al 100% de la hibridació, especialment en l'aplicació d'un curt de sondes d'ADNc disminuït significativament l'eficiència. Aplicació La tecnologia no només es pot utilitzar en una seqüència de gens coneguts o localització cromosòmica, però també es pot utilitzar per clonar gens o marcadors genètics no ho van fer i l'estudi d'aberració cromosòmica. En qualitativa gen, quantitativa, la integració, i altres aspectes de l'estudi van expressar un avantatge considerable. PEIX utilitzat originalment per metafase els cromosomes. Diferenciada de preparar en aquest nucli és altament cromosomes condensats, cada cromosoma té una forma recognoscible, mostraran una tinció característic de la posició del centròmer i tinció tipus de banda. Quan es tracta de cromosomes en metafase FISH, obtingut mitjançant el mesurament del senyal de fluorescència respecte a la posició de l'extrem del braç curt del cromosoma (valor FLpter) a ser traçat. Els cromosomes en metafase utilitzant deficiències que, atès que la naturalesa de la seva, la cartografia única baixa resolució molt condensada, almenys dos marcadors independents a 1Mb senyal d'hibridació com separada distingibles (Trask et al., 1991) . Aquesta resolució no és suficient per construir un cromosoma mapes intercanvis. Per tant metafase PEIX cromosoma s'utilitza principalment per identificar nous marcadors en els cromosomes ubicació aproximada, per altres mètodes de mapeig més sofisticats per preparar. Tot el temps, aquests "altres mètodes" no inclou cap dels peixos, però després de 1995, una sèrie de tècnica de FISH d'alta resolució s'ha desenvolupat. Aquestes tecnologies es van estudiar mitjançant la variació de la naturalesa de la preparació de cromosomes per aconseguir una resolució més gran. Metafase els cromosomes es condensen per al mapeig fi és massa alt, pel que és necessari utilitzar més cromosomes estries. Hi ha dues maneres de satisfer aquest requisit (Heiskanen et al, 1996.): Cromosoma estirament mecànic (cromosoma mecànicament estirat) canviant el mitjà per compartir el nucli obtingut pels cromosomes mètode. Shearing força centrífuga pot ser estirat a la llargada normal dels cromosomes de 20. Cada cromosoma pot encara identificar en els mètodes d'assignació de senyals FISH general davant dels mateixos cromosomes en metafase, pel que la resolució es pot millorar de manera significativa, es pot distingir a més 200 ~ 300kb marca. Metafase els cromosomes no (cromosoma no metafase) només en la meitat de l'alçada dels cromosomes condensats, mentre que les altres fases del cicle cel · lular per mantenir l'estat natural dels no envasats, els investigadors han utilitzat nucli pre-, temps de condensació cromosòmica suficient per distingir els cromosomes individuals. A la pràctica, aquest mètode no és superior a estirament mecànic lloc cromosomes. En contrast cromosomes en interfase (interfase) són més útils perquè interfase (divisió nuclear de nou entre) el nivell més baix dels envasos cromosoma. Utilitzeu cromosomes en interfase, la resolució pot arribar a 25kb o menys, però el cromosoma morfologia desaparegut, col · locant la posició de la sonda per promoure la necessitat d'una referència externa. Per tant, la tecnologia pot ser més o menys mapatge de cromosomes s'ha fet servir després d', en general com una àrea petita per determinar l'ordre cromosòmic d'una sèrie de punts. Cromosomes en interfase contenen totes les cèl · lules per al muntatge de molècules d'ADN. Per millorar encara més la resolució de FISH per 25kb o menys, cal donar un cromosoma complet, l'ús d'ADN purificat. Aquest mètode s'anomena fibra FISH (fibra FISH), utilitzant la tecnologia de gel de pentinat molecular per preparar estirat o ADN, es pot distingir la distància entre marques de menys de 10 kb. [2] Fluorescència en el procés de desenvolupament de la tecnologia d'hibridació in situ FISH per detectar el nombre de llocs i el desenvolupament de la detecció de blancs Després de la tècnica de FISH establir bàsicament, el peix és no només per un únic gen o la detecció d'àcid nucleic, tecnologia pesquera s'estén al desenvolupament de peixos multicolors detecció simultània de múltiples loci de gens, a partir del desenvolupament de les proves genètiques en el genoma, el cromosoma, en les cèl · lules vives dels ARNm transcrits originals detecció de bits i nivell de detecció d'àcid nucleic de l'organització, i en estudis futurs es poden aplicar també a la detecció de tot l'organisme. Els primers sondes de major proliferació pel transportista, el mètode de desplaçament de la mossa, en el mètode de transcripció in vitro i el mètode del cebador aleatori per preparar la síntesi d'ADN per obtenir la clonació hibridació específica. No obstant això, en general amb un gran fragment de la sonda repeteix causant una alta fluorescència de fons, l'ús d'àcid nucleic no marcat tractament previ als llocs d'inhibició de la unió i no específics de la hibridació no específica es pot utilitzar per superar els problemes anteriors, sinó que també permet als investigadors per ampliar detectar l'objectiu, per aconseguir tota una tinció cromosoma. Tant tècnica FISH en l'anàlisi citogenètica al cromosoma ha millorat significativament. Per exemple, per hibridació genòmica comparativa (hibridació Comparativegenomic) s'utilitza per detectar delecions i duplicacions de regions cromosòmiques. Una vegada que el gran fragment de sonda i la mostra formaran un senyal d'unió no específica, la detecció de gens en el cromosoma confusió, hem de tallar en petits fragments <200 nucleòtids. Ara mètodes millorats de detecció i el programari de detecció que fa que la tècnica de FISH continua desenvolupant cada vegada més exigent baixa sensibilitat de detecció és cada vegada més gran. Algorismes de processament d'imatges informàtiques necessàries seguir millorant la formació de tècniques submicroscòpiques sonda de nivell d'alta resolució. Amb l'objectiu de detecció més petita i més petita, tècnica de FISH s'ha fet servir encoberta reordenament nuclear subtelomérico gènica i cartografia cromosòmica i detecció precisa d'ARNm d'una sola còpia. PEIX expansió rang de detecció, de manera que l'aplicació de la tècnica de FISH en el ràpid creixement de la dècada de 1990. Es forma per l'aplicació de la tecnologia FISH per aconseguir un creixement branques de molts tipus diferents de loci detectats simultàniament. El primer és l'ús d'un nombre diferent de detecció de fluorescència sempre punts, com ara la fluorescència de dos colors per a la detecció de seqüències específiques d'àcids nucleics, cada cromosoma, gen o productes de transcripció es van fer llavors d'un senyal fluorescent es pot resoldre per representar. Després esquema de descodificació és l'ús de dos peixos de color ampliar encara més la gamma d'aplicacions. Programa de descodificació és principalment per a la proporció de color, és a dir, cada color en la proporció d'total de color per descriure múltiples llocs. Cadascun dels mètodes anteriors, o una combinació de tots dos enfocaments han de ser detectat fins a 12 loci. Color usant un programa de traducció automàtica pot detectar tots els cromosomes humans representen múltiples loci detectats per fita FISH. Encara que es pot utilitzar una varietat de mètodes observats ARNm, però tota l'anàlisi FISH transcripció sembla ser més aplicacions in situ. Tècnica de codificació de color s'ha aplicat en la qual es detecta a tota l'organització. |
| Usuari Revisió |
|
Sense comentaris encara |
